非小細 胞 肺 癌（ＮＳＣＬＣ）是最 常 見 的 惡 性 腫 瘤 之一，其發(fā)病率死亡率均位居惡性腫瘤第一位。 研究表明，可通過檢測肺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細 胞（ＣＴＣ）對腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)進行早期診斷。本研 究選取了一種基于微流控平臺的循環(huán)腫瘤細胞分選 儀器，通過對 分 選 出 的 ＣＴＣ 通過免疫化學(xué)染色計數(shù)，與常規(guī)腫瘤標記物進行對比，探討 ＣＴＣ 檢測用 于 ＮＳＣＬＣ早期診斷的可行性。

１ 材料和方法

１．１ 研究對象

觀察對象為２０１７年０１年至２０１９年０１月期間 在深圳市人民 醫(yī) 院 確 診 為 ＮＳＣＬＣ 的６５例癌 癥 患者。入組標準：年 齡１８－８０周歲，性 別 不 限；病 理 診 斷為 ＮＳＣＬＣ患者，所有患者均接受肺部 ＣＴ 掃描， 腹部 Ｂ超，全身骨 ＥＣＴ，頭顱 ＭＲＩ及相關(guān)實驗室檢 查以明確分期及遠處轉(zhuǎn)移；既往無腫瘤病史；入院前 未接受抗腫瘤的相關(guān)治療。排除標準：臨床檢驗判 定小細胞肺癌或其他惡性腫瘤；合并其他腫瘤患者。 本研究已經(jīng)過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準，患者對研 究知情并簽署知情同意書。

１．２ 材料和儀器

ＮＣＩ－Ｈ１９７５（非小 細 胞 肺 癌 細 胞 系）購 自 中 國 科學(xué)院細 胞 庫，活細胞熒光染料 ＣｅｌｌｔｒａｃｋｅｒＣＭＦ－ ＤＡ（貨 號：Ｃ７０２５）、細 胞 核 染 料 Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（貨號：Ｈ１３９９）、磁力架（貨號：Ａ３１５４３）購自美國 Ｔｈｅｒ－ ｍｏＦｉｓｈｅｒ公司；低速大容量離心機購自上海安亭科 學(xué)儀器廠；垂直混合儀和微型水平脫色搖床購自江蘇海門其林貝爾公司；微型臺式真空泵購自上海斯 曼峰醫(yī)療器械公司；熒光顯微鏡及單細胞挑取系統(tǒng) 購自 奧 林 巴 斯 （深 圳）工 業(yè) 有 限 公 司，ＣｌｅａｒＣｅｌｌ○Ｒ ＦＸ１循環(huán)腫瘤細胞活性分離系統(tǒng)購自新加坡的 Ｃｌｅａｒｂｒｉｄｇｅ生物醫(yī)學(xué)公司，ＣＴＣ鑒定染色過程的細 胞固定液、透化液、封閉液、抗體稀釋液、抗體混合液 （含偶聯(lián)過 氧 化 氫 酶 ｐａｎ－ＣＫ－抗體 和 偶 聯(lián) 堿 性 磷 酸 酶 ＣＤ４５）、酶顯色底物等配套試劑由深圳華大生命 科學(xué)研究院提供支持。 采用化學(xué)發(fā) 光 法 檢 測 腫 瘤 標 記 物 ＮＳＥ（貨號： ＣＰＯ１１０７０）、ＣＥＡ（貨號：ＣＰＯ１１０５０）、Ｃｙｆｒａ２１－１（貨 號：ＣＰＯ１１０４０）由深圳市人民醫(yī)院檢驗科采 用 上 海 透景生命科技股份有限公司相關(guān)試劑盒檢測。

１．３ 檢測方法

１．３．１ 細胞培養(yǎng)

ＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞用含有１０％熱 滅火胎牛血清１００ＩＵ／ｍｌ青鏈霉素的１６４０培養(yǎng)基 培養(yǎng)，培養(yǎng)的細胞用 ＤＰＢＳ 磷酸緩沖液洗滌２次后 用０．２５％胰蛋白酶消化傳代或收獲細胞。

１．３．２ 細胞摻入與細胞回收率統(tǒng)計

ＮＣＩ－Ｈ１９７５ 細胞培養(yǎng)至融合度約為８０％后用胰酶進行消化，加 入 ＣｅｌｌｔｒａｃｋｅｒＣＭＦＤＡ 染色工作液，于細胞正常生 長條件下孵 育３０ ｍｉｎ。換用新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng) ３０ｍｉｎ，將細胞 用 ＰＢＳ漂洗 后，在熒光顯微鏡下使 用單細胞挑取系統(tǒng)挑取準確數(shù)量的細胞，按 照 ５ＣＴＣ／３ ｍｌ、２５ＣＴＣ／３ ｍｌ、５０ＣＴＣ／３ ｍｌ摻 入 全 血 中，每組設(shè)３個組內(nèi)平行。 分別按照ＣＴＣ定量檢測試劑盒及ＣｌｅａｒＣｅｌｌ○Ｒ ＦＸ１ 循環(huán)腫瘤細胞活性分離系統(tǒng)說明書進行 ＣＴＣ分離操 作，得到的細胞懸液置于９６孔板中，在熒光顯微鏡下 進行觀察計數(shù)。按以下公式進行回收率計算：ＣＴＣ回 收率＝觀測ＣＴＣ數(shù)量／摻入ＣＴＣ總數(shù)×１００％。

１．３．３ ＣＴＣ 的定量檢測

每 位 受 試 者 采５ｍｌ血 液樣本，用 含 肝 素 鈉 的 ＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ管收 集 后 保 存于４℃冰箱，并且在采集后６ｈ內(nèi)進行處理。ＣＴＣ 的定量檢測按照ＣｌｅａｒＣｅｌｌ○ＲＦＸ１循環(huán)腫瘤細胞活性 分離系統(tǒng)說明書進行操作。ＣＴＣ分離后，按照邁新 生物雙重免疫化學(xué)染色標準步驟進行染色鑒定，在 熒光顯微鏡明場下進行觀察并計數(shù)。

１．４ 統(tǒng)計學(xué)處理

使用 ＳＰＳＳ２０．０軟件 進 行 統(tǒng) 計 分 析，計 數(shù) 資 料 采用χ ２ 檢驗進 行 分 析，以 Ｐ＜０．０５為差 異 有 統(tǒng) 計學(xué)意義。

２ 結(jié)果

通過 ＣＴＣ 分離回收效率公式計算標記并染色 的 ＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞回收效率。實驗結(jié)果顯示，通過 循環(huán)腫瘤細胞滲入實驗，ＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞的回收率 為（８３．３－８６．３）％，平均值為（８５．０±１．５）％（表１）。

為確定經(jīng)免疫化學(xué)染色鑒定后的腫瘤細胞形態(tài) 特征，我們先 對 ＮＣＩ－Ｈ１９７５肺癌 細 胞 系、正 常 人 外 周血單核細胞 ＰＢＭＣ進行了染色鑒定，染色后腫瘤 細胞呈現(xiàn)典型的紅色，ＰＢＭＣ 染色后呈現(xiàn)典型的藍 黑色，形態(tài)特征見下圖１。


３ 討論

研究表明，循環(huán)腫瘤細胞與多種惡性腫瘤的臨 床病理分期及預(yù)后密切相關(guān)，其在遠處轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā) 中的作用也日益受到關(guān)注。由于外周血循環(huán)腫瘤 細胞水平極低 ，這使得富集分離循環(huán)腫瘤細胞挑戰(zhàn) 巨大。目前，包括基于細胞物理學(xué)特性的方法、基于 磁性親和選擇的分選方法和基于微流體的生物學(xué)的 分選方法在內(nèi)，各種循環(huán)腫瘤細胞檢測技術(shù)發(fā)展迅 速，但大多處于研發(fā)階段，從技術(shù)平臺和臨床應(yīng)用角度仍有巨大發(fā)展空間。微流控技術(shù)是近些年在循環(huán) 腫瘤細胞檢測領(lǐng)域新興的重要技術(shù)平臺，其利用不 同方法的捕獲效率基本在７０％以上。本研究選 取了一種具有高效、不依賴腫瘤細胞表面標志物特 點的基于微流控平臺的循環(huán)腫瘤細胞分選儀器，其 原理是基于尺寸大小不同的細胞在微流控芯片中表 現(xiàn)出力學(xué)特征的不同，從而通過慣性遷移達到分離 的效果。

 

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